葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)试剂盒,微板法

葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)试剂盒,微板法

葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 

 葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase)活性测定试剂盒说明书

(货号：WS7550W 微板法 96 样) 

一、产品简介： 葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase，G6Pase，EC 3.1.3.9）主要存在于肝脏、肾 脏、 小肠粘膜细胞、胰岛细胞中，催化 6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖的关键酶，该反应是糖原 分解和糖异生的最后一步反应。在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。 本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法：G6Pase 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄 糖，变旋酶和葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NAD+还原生成 NADH，NADH 与一种显色 探针反应生成有色物质，通过检测该有色物质的增加速率即可计算出 G6Pase 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部， 再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解， 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部， 再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解， 试剂三 液体μL×1 支 -20℃保存 用前甩几下使液体落入底部， 再加 1mL 蒸馏水充分溶解， 试剂四 液体 1mL×1 支 4℃保存 试剂五 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌 或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间 隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，设置温度 25℃,调节波长至 450nm。 ② 试剂解冻至室温（25℃）；若一次检测样本数较多，可将试剂一和二和三等比例混匀 后再一起加 30μL，其他试剂加样量不变 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 10 试剂四 10 试剂五 150 混匀，25℃条件下，立即于 450nm 处读取 A1 值，20min 后读取 A2 值，（观察：酶活性越大， 则黄色越明显）。ΔA=A2-A1。 【注】：1.若ΔA 过小，可以延长反应时间（如：60min 或更长）再读取 A2， 或增加样本加样体积 V1（如增至 30μL，则试剂五相应减少），则改 变后的反应时间 T 和加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若样本自身含有较高水平葡萄糖，为了消除样本自身的背景值，需增设一个样本 自身对照，即对照管换成 10μL 的煮沸样本（95-100℃煮沸 10min,室温离心，取上 清液测定），其他不变。ΔA= A2 测定- A2 对照。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.077x - 0.001；x 是 NADH 摩尔质量（nmol），y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活单位。 G6Pase(nmol/min /mg prot)=[(ΔA+0.001)÷0.077]÷(V1×Cpr)÷T=64.94×(ΔA+0.001)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟催化 1 nmolNAD+生成 1nmol NADH 定义为一个酶活单位。 G6Pase(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.001)÷0.077]÷(W×V1÷V)÷T=64.94×(ΔA+0.001)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 单位定义：每 1 万个细胞/细胞每分钟催化 1nmolNAD+生成 1nmol NADH 定为一个酶活单位。 G6Pase(nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.001)÷0.077]÷(500×V1÷V)÷T=0.13×(ΔA+0.001) V----加入提取液体积，1 mL； V1----加入样本体积，0.01mL； W----样本质量，g。 T----反应时间，20 min； Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 1.41mL 蒸馏水（母液需在 两天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 按照 10μL 标准品+10μL 试剂四+180μL 试剂五加样体系操作，根据结果即可制作标 准曲线。