Super Fluor 488

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一．实验步骤

1.1 蛋白溶解：用0.1 M NaHCO3 溶解至终浓度为2mg/mL 

将1mL 去离子水加入84mg NaHCO3 瓶中，配成1M 的碳酸氢钠溶液。振荡或吹打至*溶解。该溶液pH 约8.3，2～6℃保存可用2个星期；若抗体是溶液，将抗体稀释至2mg/mL，再加入1/10 体积的上述碳酸氢钠溶液；若抗体是冻干粉，将1M 碳酸氢钠溶液用10 倍去离子水稀释成0.1M 后，用其将抗体溶成2mg/mL 的溶液。

1.2 染料溶解：染料固体粉末从冰箱放入干燥器中慢慢升至常温后，用无水DMSO将染料配置浓度为1 mg/mL。

1.3 标记：在1mL蛋白溶液中缓慢加入适量染料溶液，（蛋白:染料摩尔比=1:20～50；质量比可在以下范围内优化 10～200ug Super dye每毫克IgG抗体）。同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。也可以直接将蛋白溶液直接加入染料的固体粉末的试剂瓶中，同时在暗处常温缓慢搅拌1小时。

1.4 纯化：选择下面三种方式纯化后，产品冷冻干燥成粉末或在0.01 M PBS/2mM 溶液中，-20℃避光储存。

1.4.1 透析法：

1）简单纯化可用100 mL 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4次,每次4小时除去未标记上的染料。 

2）在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。  

3）用100 mL 0.01 M PBS/ 0.01% 溶液常温避光透析4小时, 在4°C常温避光再次透析过夜。 

4）用0.22 μm注射器过滤头过滤抗体溶液。

1.4.2 P-30柱子

1）0.5g p-30凝胶加入9mLPBS（pH=7.4）室温过夜放置；次日，弃上清；真空抽滤5min。

2）加入9mLPBS，轻柔震荡均匀，放置20min后，去除上清液。

3）再重复2）。

4）将树脂柱放入一个13×100mm 的玻璃管柱中，每个柱子加入1.5mL（不要多加），填的要均匀不能有气泡。具体方法是：搅动纯化树脂（组分C），加入1.0mL 悬浮液至空柱中静置；全部下沉后再加入0.5mL树脂至床体积为～1.5mL盖上盖子，可以室温保存。

5) 将树脂柱上下端的口打开，放入10mL离心管中由于重力水自然流下，用垂直转子1100g 离心3min，rpm 与相对离心力g 的换算公式如下：相对离心力g=(1.12×10-5)(rpm)2(半径cm)；离心后静置待缓冲液全部流出，弃去缓冲液，保留收集管（若没有垂直转子，角转子也可）。

6) 换上干净的离心管，将标记的蛋白反应液200μL逐滴加入树脂柱的中心部位，使溶液被吸入胶床中；

7) 将树脂柱放入空的收集管中，1100g 离心5min；

8）离心后，收集管内是标记好的蛋白，溶在100μLPBS 中，pH7.2，包括2mM 的叠氮钠。未结合的染料保留在柱中，弃去树脂柱。

注意事项：配置柱子时，用较细的小瓶，每个小瓶配置2个柱子。便于去除水分。填柱子时，加到1.5mL，尽量不要多加，离心时间按照说明书1000g/3min，不要随便更改。